显微镜与生命科学

显微镜与生命科学

显微镜在生命科学的发展中起着不可估量的作用。它带领人类打开了微生物世界的大门，探索着复杂而又完美的有机生物。从最初的放大镜，到如今的电子显微技术，荧光显微技术，显微镜的蓬勃发展也带动了生命科学的进展。如今，人们以能够从分子水平对细胞进行观察，研究，操作，于是又出现了细胞学。基因学，蛋白学，神经学等新的生命学领域。显微镜也将在这些领域的发展中大显身手。

     荧光显微镜是以紫外线为光源，用以照射被检物体，使之发出荧光，然后在显微镜下观察物体的形状及其所在位置的一种新型显微镜。目前主要有四部分组成：超高压汞灯，滤色系统，聚光镜和反光镜。超高压汞灯（100w或200W）光源的电路和包括变压、镇流、启动几个部分。在灯室上有调节灯泡发光中心的系统，灯泡球部后面安装有镀铝的凹面反射镜，前面安装有集光透镜。工作时由两个电极间放电，引起水银蒸发，从而达到超高压。通过电极间放电使水银分子不断解离和还原，发射光量子，发射出很强的紫外和蓝紫光，进而激发各类荧光物质。滤色系统是荧光显微镜的重要部位，由激发滤板和压制滤板组。激发滤板分薄厚两种，一般暗视野选用薄滤板，亮视野荧光显微镜可选用厚一些。基本要求是以获得最明亮的荧光和最好的背景为准。压制滤板的作用是完全阻挡激发光通过，提供相应波长范围的荧光。反光镜的反光层一般是镀铝的，因为铝对紫外光和可见光蓝紫区吸收少，一般使用平面反光镜。专为荧光显微镜制作的聚光器是用石英玻璃或者其他透紫外光的玻璃制成。分明视野聚光器和暗视野聚光器两种。

    荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另外有一些物质本身如虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。

    激光扫描共聚焦显微镜用激光做扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共聚焦激光扫描显微镜有较高的分辨力。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都存储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。激光扫描共聚焦显微镜的单色性非常好，光源波束的波长相同，从根本上消除了色差，并且采用共聚焦技术在物镜的焦平面上放置了一个当中带有小孔的挡板，将焦平面以外的杂散光挡住，消除了球差，并进一步消除了色差。

    激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量，配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。还可以对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态的检测。目前，激光扫描共聚焦技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定，定量图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域得到广泛的应用。

    双光子荧光显微镜是结合了激光扫描共聚焦显微镜和双光子激发技术的一种新技术。双光子激发的基本原理是：在高光子密度的情况下，荧光分子可以同时吸收2个长波长的光子，在经过一个很短的所谓激发态寿命的时间后，发射出一个波长较短的光子；其效果和使用一个波长为长波长一半的光子去激发荧光分子是相同的。双光子激发需要很高的光子密度，为了不损伤细胞，双光子显微镜使用高能量锁模脉冲激光器。

    双光子荧光显微镜有很多优点：长波长的光比短波长的光受散射影响较小，容易穿透标本；焦平面外的荧光分子不被激发，使较多的激发光可以到达焦平面，使激发光可以穿透更深的标本；长波长的近红外光比短波长的光对细胞毒性小；使用双光子显微镜观察标本的时候，只有在焦平面上才有光漂白和光毒性。所以，双光子显微镜比单光子显微镜更适合用来观察厚标本、更适合用来观察活细胞、或用来进行定点光漂白实验。

    全内反射荧光显微镜是利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域的一款新型显微镜。其观测的动态范围通常在200nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测指标，故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。该显微镜信噪比高，分辨率高，对生物样本的损伤小，可进行活体物质的研究和单分子的动态研究。

    全内反射荧光显微镜正是凭其独特的优势，从而成为研究细胞表面科学如生物化学动力学，单分子动力学的最有前途的光学成像技术。现在全内反射荧光显微技术已被广泛应用于：实时观察单个肌浆球蛋白分子的运动；单个蛋白分子对之间的荧光共振能量转移：聚合物单个分子的结构变化；生物质膜附近的神经分泌腺的颗粒运动等。全内反射荧光显微技术的发展，一方面会在加强传统优势的基础上，即动态观察生物大分子的结构，相互作用，物质的分泌，同时在不断的改进物镜和CCD相机的性能基础上进一步同其它仪器的结合，更多的用在生物细胞活体方面的研究。

    近场光学是指当光探测器及探测器---样品间距均小于辐射波长条件下的光学现象。利用近场光学扫描显微镜和近场光谱仪，不但能够以突破衍射极限的超高分辨率在纳米尺度实现光学成像，而且还可获得纳米微区的光谱信息。

    近场光学显微技术的发展，得到了许多前所未能测得的光学讯号及应用物理上的新发展。如单一染料分子的荧光近场显微光学影像，单一分子及单一蛋白质的近场光化学及其超快光学动态测量等。预期此一新技术会被大量且迅速地应用在生物、医学、半导体及高分子材料等的研究上。此外，在纳米技术领域中，近场光学显微技术除了可用以去的极小区域的光学讯号作为光学影像或光谱研究之用，还可成为研究样品表面上纳米尺寸的区域中，改变或主导样品表面结构或物理性质的一种新工具。相信在不久的将来，也会成为纳米制造技术中一个重要部分。

    通过对以上显微镜的原理介绍及其在生命科学领域的广泛应用，可以看出，显微镜的技术发展，与生命科学的发展密不可分。尤其是当生命科学发展到当今的细胞水平，分子水平上之后。在将来，显微镜将对生命学科的发展贡献出更大力量，而我们人类也将在这两者的完美结合中获得更大收益。